Os problemas mais comuns que ocorrem em análises de HPLC são baixa sensibilidade e desvios da linha de base, ruído ou picos no cromatograma. Estes fenômenos podem ser normalmente problemas na fase móvel. A DCtech, em conjunto com a Knauer, simplifica para você este vilão e disponibiliza dicas valiosas para sua análise correr sem problemas.
Presença de contaminantes
Contaminantes no eluente são os maiores causadores de problemas, especialmente em análises com gradiente. A linha de base pode subir e picos desconhecidos aparecerem à medida em que a concentração dos contaminantes for subindo. A água é a maior fonte de contaminantes nas análises de fase reversa. Você deve utilizar somente água ultrapura deionizada na preparação de sua fase móvel. Entretanto, muitos deionizadores comuns introduzem contaminantes orgânicos na água. Para remover estes contaminantes, passe a água deionizada através de carvão ativo ou uma coluna preparativa C18. Use somente solventes de grau HPLC, inclusive sais, reagentes de pareamento iônico e modificadores de ácido e base. Limpar solventes de baixa qualidade consome tempo e traços de contaminantes frequentemente se mantém, causando problemas quando você usa detectores UV ou fluorescência de alta sensitividade.
Fungos ou Algas nas soluções tampão
Sabendo-se que muitas soluções tampão promovem o desenvolvimento de fungos e algas, você deve descartá-las se estiverem turvas e prepará-las frescas novamente. Você pode prevenir o crescimento de microrganismos na solução tampão através da adição de uma solução de 100 ppm de azido de sódio às soluções tampão aquosas. Alternativamente, essas soluções tampão podem ser misturadas com 10%, 20% ou mais de um solvente orgânico como metanol, etanol ou acetonitrila.
Presença de bolhas ou gases dissolvidos
Para prevenir bolhas no sistema, degaseifique a fase móvel previamente ao uso. Recomendamos o uso contínuo de uma unidade degaseificadora. Filtrar a fase móvel através de filtros de 0,2 ou 0,45 µm usando um aparato de filtração à vácuo elimina a presença de gás dissolvido, além de remover partículas que poderiam gerar ruído na linha de base ou entupir a coluna.
Reagentes de pareamento iônico
Use reagentes de pareamento iônico com cautela. O comprimento ótimo de cadeia e a concentração do reagente deve ser cuidadosamente determinada para cada análise. Em geral, aumentando-se o tamanho da cadeia ou concentração resulta em um aumento nos tempos de retenção.
Recomendamos o uso de concentrações de 0,2 a 10 mM. Altas concentrações de acetonitrila (>50%) e alguns outros solventes orgânicos podem precipitar os reagentes de pareamento iônico. Isto pode ser evitado através do uso de soluções tampão contendo sódio na presença de uma cadeia longa de ácidos sulfônicos (por exemplo, dodecil sulfato de sódio), ao invés de soluções tampão contendo potássio. Modificadores voláteis básicos ou ácidos, como trietilamina (TEA) ou ácido trifluoracético (TFA) são úteis quando você deseja recuperar um composto para uma análise subsequente. Estes modificadores também ajudam você a evitar problemas associados com os reagentes de pareamento iônico. Eles podem ser adicionados à solução tampão em concentrações de 0,1 a 1% para TEA e 0,05 a 0,15% para TFA. Aumentando-se a concentração pode-se melhorar o formato dos picos para certos compostos, mas isto alterará os tempos de retenção.
Confira também os posts detalhados que estamos fazendo dos outros problemas do guia em nosso blog nesse link.
