Historicamente, é muito desafiador realizar estudos de biodisponibilidade e bioequivalência para medicamentos semissólidos com o propósito de demonstrar a qualidade continuada, eficácia e similaridade do produto quando se implementam certas mudanças no processo de manufatura ou se substitui excipientes.
Por outro lado, testes in vitro como a determinação de solubilidade, tamanho de partícula, taxa de liberação do ingrediente ativo e homogeneidade do produto tem sido as principais medidas de uniformidade de produto e equivalência de qualidade.
Entre estes, testes de liberação in vitro do ingrediente ativo e homogeneidade do produto tem chamado bastante atenção como resultado da publicação pelo FDA do SUPAC-SS (Guia para a indústria para formas de dosagem de semissólidos não estéreis).
Muitos fabricantes de drogas tópicas têm dedicado recursos significativos para desenvolver e validar testes de liberação in vitro durante o processo de desenvolvimento do produto. Entretanto, não existe um protocolo de testes padrão que poderia ser aplicado a todas as formas semissólidas.
Foi desenvolvido um teste de liberação de ácido retinóico em várias formulações semissólidas usando-se células Franz. Esse produto é comumente utilizado no combate a acne comum. Os produtos testados continham ácido retinóico em novas formulações tanto em creme como em pomada.
O método do teste de liberação in vitro foi desenvolvido e validado utilizando como referência o produto Retin-A® Creme porque ele está disponível em diversas concentrações e a liberação do ácido retinóico desse produto foi extensamente estudada. O método do teste de liberação in vitro foi então aplicado ao desenvolvimento de formulação e demonstração do efeito das mudanças de processo de fabricação.
Desenvolvimento do Método de Liberação In Vitro
Método de Ensaio
Apesar de um método de ensaio estar normalmente disponível para a substância de interesse e seus compostos relacionados, ele pode não ser adequado para a análise desses compostos no meio receptor selecionado.
Na maioria dos casos, a modificação na metodologia e a validação completa do método modificado são requeridos para garantir os resultados do método de teste de liberação in vitro.
O método de ensaio foi modificado (originalmente validado para ácido retinóico e seus compostos relacionados) para quantificar níveis mais baixos de ácido retinóico no meio receptor, tampão de fosfato (pH 5,5) contendo 30-35% de etanol, que foi demostrada ser a faixa aproximada da fase orgânica para a liberação desse ingrediente ativo.
Seleção da membrana
A membrana selecionada deve promover uma superfície de apoio inerte para a formulação em teste, mas não uma barreira. A escolha da membrana deve permitir que o ingrediente ativo se difusa imediatamente no meio receptor à medida em que seja “lançado” da forma de dosagem.
É importante confirmar que não existe interação, física ou química, entre a membrana e a formulação. Os excipientes presentes na formulação podem afetar a integridade física da membrana ou, em muitos casos, o ingrediente ativo pode se ligar à membrana. Além disso, a membrana não deve conter quaisquer “lixiviados” que podem causar interferência ao ensaio do ingrediente ativo.
A bateria de membranas que estão inclusas no início do desenvolvimento do método: membranas comumente usadas são Tuffryn®, Supor®(polisulfone), Cellulosic, Acetate Plus® (acetato de celulose), Nylon, Teflon e Policarbonato.
É recomendado que as soluções padrão do composto testado no meio receptor sejam preparadas em dois níveis de concentração, nos intervalos de concentração mais alto e mais baixo esperados para o teste de liberação in vitro, para verificar a extensão da ligação da droga com a membrana.
Soluções padrão de ácido retinóico foram passadas através desses filtros de membrana, e as soluções padrão filtradas foram analisadas para recuperação de ácido retinóico. Para formulações que contém ácido retinóico, concentrações de drogas de 0,1 e 0,2 µg/ml foram selecionadas para teste baseado na literatura de referência.
Entre as membranas avaliadas, membranas de polisulfona (Tuffryn® e Supor®) mostraram uma retenção significativa de ácido retinóico a níveis baixos (0,02 µg/ml). Membranas Acetate Plus® mostraram a melhor recuperação sem interferência positiva por HPLC.
Dessa forma, essa membrana foi escolhida para o desenvolvimento e validação da metodologia. É recomendado em muitas publicações o pré-tratamento da membrana, embebendo-a no meio receptor e/ou 0,5% de miristato de isopropila. Entretanto, para as formulações de ácido retinóico, o pré-tratamento da membrana não oferece benefício no perfil geral de liberação.
Seleção do Meio Receptor
Apesar de ser desejável que se tenha um meio receptor que é similar a condição fisiológica da pele, é também imperativo certificar-se que a droga a ser liberada seja mensurada sem interferência.
O fator mais importante da seleção do meio receptor é a solubilidade do ingrediente ativo no meio. O meio receptor deve prover uma “pia difusora” para o ingrediente ativo liberado da formulação semissólida. A relação entre Q (quantidade acumulada liberada) versus √T (raiz quadrada do tempo) é derivada do modelo Higuchi com a suposição de que existe um reservatório da droga sempre disponível para difusão. Como regra geral, não deve haver mais de 30% do valor total da dose aplicada liberada do meio no final do experimento.
O pH do meio é também um fator importante para consideração. Seleção do pH do componente aquoso do meio deve ser baseado no pH da formulação, perfil de solubilidade por pH do ingrediente ativo e o pH da membrana alvo. Uma consideração prática é escolher um meio receptor que permita quantidades suficientes do ingrediente ativo seja liberado dentro de um período razoável para garantir uma análise precisa das amostras de taxa de liberação.
A solubilidade do ácido retinóico em meio tampão de etanol é suficiente para cumprir todos os requerimentos discutidos anteriormente. Depois de alguns poucos experimentos preliminares, um tampão fosfato de pH 5,5 com 35% de etanol foi selecionado como meio receptor. Tampão fosfato com 35% de etanol permitiu níveis de ácido retinóico suficientes para a difusão através das formulações em desenvolvimento para uma análise precisa de ácido retinóico. Testes paralelos em diversas formulações investigativas foram realizadas usando-se tampão de pH 3,5 e pH 5,5, que representam o pH da formulação testada e pH da pele, respectivamente.
Perfis de liberação do produto referência Retin-A® 0,025% creme mostrou uma liberação maior de ácido retinóico no meio receptor tamponado para ambos pH. O tampão de pH 5,5/ etanol (65:35 v/v) foi escolhido como meio receptor no desenvolvimento. Pequenas mudanças na concentração de álcool não mostraram mudanças significativas na taxa de liberação de ácido retinóico no Retin-A® 0,025% creme.
Seleção de parâmetros relativos ao equipamento e Cálculo de Liberação da Droga
Os seguintes parâmetros específicos relacionados ao equipamento devem ser considerados no teste de liberação em desenvolvimento.
- Aparato: geralmente, seis células Franz de difusão são usadas no desenvolvimento de um método para teste de liberação para anular variabilidades individuais de dose.
- Temperatura: na maioria dos casos onde a forma de dosagem é aplicada a pele, 32OC é apropriado. Exceções se aplicam quando o órgão alvo é uma membrana como a mucosa vaginal para a qual 37oC é mais apropriada. Nós usamos 32oC em todos os experimentos.
- Intervalos de amostragem: 0,5, 1, 2, 4, 6, 8 (opcional), 24 e 48 horas (opcional).
- Volume de amostragem: 200 µL em cada ponto com volume reposto com meio fresco a cada coleta.
No próximo artigo dessa série, falamos sobre a Validação dessa metodologia desenvolvida.
Referência: Development and Validation of In Vitro Release Tests for Semisolid Dosage Forms—Case Study, Kailas D.Thakker,Ph.D. and Wendy H.Chern,Ph.D., Dissolution Technologies, MAY 2003.
