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Cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) e cromatografia líquida de alta performance (HPLC): dois métodos de cromatografia líquida comparados frente a frente. Este artigo discute as diferenças entre as duas técnicas, com particular ênfase nos requisitos de seus respectivos analitos.

Os nomes de cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) e cromatografia líquida de alta performance (HPLC) oferecem uma dica para as diferenças entre esses métodos cromatográficos:

• Enquanto a HPLC funciona em alta pressão para analisar pequenos compostos químicos, FPLC purifica grandes biomoléculas como proteínas ou DNA.
• A cromatografia de biomoléculas é muito exigente e sensível porque não suporta altas temperaturas, altas pressões ou os solventes normalmente utilizados em HPLC. Por estas razões, a separação de biomoléculas requer uma abordagem alternativa à HPLC.

Vários termos são comumente usados ​​para cromatografia rápida em proteínas líquidas, como biocromatografia, biosseparação ou biopurificação. Esta forma especial de cromatografia é aplicada para purificar grandes biomoléculas de vários kilodaltons (kDa) tais como proteínas, nucleotídeos ou peptídeos.

• O objetivo do usuário do FPLC é obter o máximo de produto puro e nativo possível.
• Os objetivos da técnica HPLC clássica, por outro lado, são identificar e qualificar analitos, geralmente compostos pequenos que variam em tamanho de alguns átomos até aproximadamente 3000 Da.

O desafio de obter uma proteína pura de um extrato celular

Tipicamente, as biomoléculas são purificadas a partir de células bacterianas ou eucarióticas, que são embaladas com proteínas, DNA, RNA e membranas celulares. Assim, a purificação da proteína de interesse de um extrato celular pode ser muito desafiadora.

Os bioquímicos aplicam vários truques: um é usar proteínas recombinantes, que são abundantes nas células. Essa abundância da proteína de interesse permite a purificação em quantidades maiores.

O segundo truque é adicionar um marcador (tag) à proteína de interesse, que é especificamente reconhecida pela resina (material da coluna). As proteínas sem um marcador não se ligam à coluna e eluirão imediatamente, enquanto a proteína desejada é enriquecida e pode ser facilmente separada.

As biomoléculas são purificadas a partir de lises celulares, o que significa volumes de amostra muito maiores do que em HPLC analítica. Portanto, os tubos de carregamento de amostra maiores ou mesmo as bombas com vazão maior são usados para injetar a amostra.

Além disso, os materiais das colunas de FPLC e HPLC diferem completamente:

• Para HPLC, são usados grânulos de sílica com tamanhos de partículas muito pequenos e com grande resistência a altas pressões, enquanto a FPLC requer material de agarose ou polímeros com tamanhos de partículas maiores para a maioria dos métodos.
• As resinas utilizadas para FPLC não são tão estáveis ​à pressão quanto as esferas de sílica e são muito sensíveis a bolhas de ar.
• Além disso, não só o enchimento da coluna, mas também o hardware da coluna difere.
• Na HPLC clássica, são utilizadas colunas de aço inoxidável resistentes à pressão. Como já mencionado, a estabilidade da pressão não é importante para FPLC e, portanto, é possível trabalhar com colunas de vidro transparentes e biocompatíveis. Esta é uma grande vantagem, uma vez que o usuário pode verificar a coluna para verificar a presença de bolhas de ar ou monitorar a condição do material durante uma corrida de purificação.

Diversas biomoléculas, vários métodos

As diferenças no material da coluna também refletem nos métodos.

• Na HPLC analítica, a cromatografia de fase reversa com fases estacionárias hidrofóbicas e fases móveis polares é o método de escolha, enquanto que no FPLC é aplicada uma maior variedade de métodos.
• Um método de FPLC é a cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) onde as moléculas são separadas de acordo com o tamanho. Moléculas menores podem se difundir para dentro dos poros do enchimento, enquanto as moléculas maiores passam pela coluna quase sem serem retidas. As moléculas menores eluem depois na coluna gerando um gradiente dessas moléculas de acordo com seu tamanho.
• Outra abordagem de separação é a cromatografia de troca iônica. As biomoléculas são separadas e purificadas de acordo com a sua carga específica, que depende do pH do tampão. Quanto mais carregada a proteína, melhor ela irá se ligar à resina carregada opostamente. Para eluir a proteína da coluna, a concentração de íons de sal é aumentada durante a corrida. Os íons de sal competem com a proteína para se ligar à resina.
• Outro método FPLC importante é a cromatografia de afinidade, onde a molécula de interesse pode se ligar especificamente à coluna, enquanto as outras moléculas não podem e serão eluídas sem ligação. Aqui são usadas colunas com meio especial que reconhecem a biomolécula desejada.
• Uma forma especial de cromatografia de afinidade é a afinidade de íons metálicos imobilizados (IMAC). A proteína de interesse deve ser geneticamente alterada pela adição de um marcador à proteína, que geralmente consiste em seis histidinas. A resina IMAC reconhece especificamente esta “His-tag”. A eluição ocorre ao aumentar a concentração de imidazol que compete com as proteínas marcadas. Além disso, as proteínas também podem ser separadas por sua hidrofobicidade específica usando o método de separação de interação hidrofóbica. A resina é composta de tal forma que as proteínas mais hidrófobicas se ligam mais fortemente à coluna e são eluídas pela diminuição do gradiente de sal.

Para purificar uma proteína desejada, geralmente é utilizada uma combinação de metodologias.

1. No primeiro passo, o chamado passo de “captura”, a proteína é purificada a partir do extrato bruto. Tipicamente, a cromatografia de afinidade é usada para este primeiro passo da purificação.
2. O segundo passo, o passo “intermediário”, remove uma contaminação adicional por cromatografia de troca iônica ou interação hidrofóbica.
3. O objetivo do passo final de “polimento” – geralmente um passo de cromatografia de exclusão de tamanho – é eliminar todas as impurezas remanescentes para obter um produto de alta pureza.

Esta estratégia de purificação de proteínas depende totalmente da biomolécula específica. Em alguns casos, uma purificação em duas etapas pode ser suficiente.

Quanto mais métodos forem combinados, mais a proteína de interesse é perdida durante a purificação, mas uma maior pureza pode ser alcançada.

Após a purificação, a amostra atingida pode ser analisada quanto à pureza, concentração e função ou atividade enzimática usando HPLC, eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE), ensaios de atividade enzimática ou espectrometria de massa.

Requisitos para FPLC

As proteínas são compostas por aminoácidos alinhados como uma cadeia. Esta cadeia é dobrada em uma estrutura tridimensional, que é a chave para a função e atividade de cada proteína. Portanto, é muito importante manter essa estrutura proteica durante o processo de purificação.

Fatores externos como alta temperatura, alta pressão, pH extremo ou solventes podem perturbar a estrutura proteica e, portanto, são evitados na FPLC. A temperatura de trabalho para proteínas é geralmente de 4 ° C. É por isso que um equipamento de FPLC é frequentemente colocado dentro de uma câmara fria ou quarto refrigerado onde é exposto não apenas a baixa temperatura, mas também à condensação de umidade.

Os componentes de um sistema FPLC devem ser especialmente concebidos para estas condições. Além disso, os componentes FPLC encontram um desafio adicional, a saber, soluções tampão salinas que são usadas como eluentes. O pH isosmótico e as concentrações de sal semelhantes ao ambiente celular são geralmente escolhidas.

Os sistemas de cromatografia são geralmente feitos de aço inoxidável. Por um lado, o sal nas solução tampão pode levar à corrosão e, por outro lado, os íons metálicos do aço inoxidável podem interferir com a proteína e perturbar sua estrutura.

Portanto, é importante evitar o aço inoxidável e usar material biocompatível, como cerâmica de poliéter éter cetona (PEEK) ou titânio quando a técnica de FPLC for utilizada.

Como os sistemas HPLC, os sistemas FPLC também são controlados por software. Existem diferenças consideráveis ​​entre o software FPLC e o software HPLC. O último é usado principalmente para analisar as amostras e contém muitas ferramentas analíticas. No entanto, no FPLC, não são necessárias muitas ferramentas analíticas e é comum gerar métodos baseados no volume ou mesmo no volume da coluna. Para a maioria dos aplicativos FPLC, os métodos baseados em volume de colunas são preferidos, facilitando a simplificação. O software PurityChrom® é muito intuitivo e fácil de usar e inclui controle direto, que permite ajustes dos parâmetros durante uma execução. Assim, o usuário pode reagir em diferentes situações de forma muito espontânea.

Dessa forma, está claro que existem grandes diferenças entre estas duas áreas cromatográficas. Métodos, hardware e software diferem muito dependendo se a molécula é analisada ou purificada. Para aplicações de FPLC, a natureza sensível das amostras e a ambição de mantê-las tão nativas quanto possível, contribuem para o desafio. Em geral, ambas as técnicas são áreas altamente interessantes que todos os que trabalham no campo devem estar cientes.

Comparação entre FPLC e HPLC