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Os cuidados com colunas HPLC e o uso apropriado de uma coluna de cromatografia líquida é extremamente importante para a sua vida útil e, consequentemente, para a qualidade da sua análise de HPLC.

Este post irá lhe dar algumas dicas sobre o uso, limpeza e armazenamento de colunas de HPLC e UHPLC. Estas diretrizes dependerão da natureza do suporte cromatográfico e da química de superfície da fase estacionária correspondente.

Cada coluna Knauer é individualmente empacotada e testada para garantir um desempenho confiável. O certificado de teste que acompanha a coluna inclui um cromatograma teste e dados específicos da coluna com relação ao seu desempenho. O número de série da sua coluna está registrado no certificado assim como no seu rótulo.

Para garantir que a coluna possa lhe prover resultados cromatográficos confiáveis, por favor siga as diretrizes abaixo.

Instalação da coluna

Por favor manuseie a coluna com cuidado, cada queda ou choque pode danificar o seu empacotamento do seu recheio. A coluna é entregue de fábrica com acabamentos de PEEK nas suas extremidades. Remova os acabamentos de PEEK antes da instalação da coluna.

Lave todos os capilares com um solvente compatível antes do uso da coluna. Quando a coluna é entregue, ela contém o solvente listado no seu certificado de teste (a coluna também é armazenada com esse solvente no seu recheio para sua segurança). Certifique-se que sua fase móvel seja compatível com o solvente de estocagem. Se não, lave a coluna com um solvente intermediário que seja compatível com ambos solventes.

O recomendado é o isopropanol. O sentido do fluxo é dado por uma seta no rótulo da coluna.

Primeiramente, conecte a coluna somente ao injetor, lave o sistema e a coluna em um fluxo baixo e gradualmente aumente o fluxo até o valor desejado. Finalmente, depois de aproximadamente 10 minutos, conecte a coluna ao seu detector. Este procedimento evitará a formação de bolhas na célula de fluxo.

Antes do início de qualquer análise, verifique se há vazamentos observando a pressão de trabalho ou usando uma unidade controladora de fluxo.

Estabilidade de pH

Em geral, colunas à base de sílica são estáveis entre o pH de 2 e 8.

Quando o pH for medido, ele deve ser feito no meio aquoso antes de misturar o eluente com os solventes orgânicos. Isso dará uma medida mais precisa de pH que medindo o pH em um meio de uma mistura aquosa e orgânica. Algumas colunas de cromatografia líquida podem ser utilizadas fora desse intervalo de pH.

A nova química de ligação permite a operação com o pH entre 1 e 12 para algumas fases estacionárias. Entretanto, verifique a informação do fabricante primeiro antes de utilizar uma coluna à base de sílica fora da faixa do pH de 2 a 8.

Estabilidade mecânica

Fases estacionárias baseadas em sílica com tamanho de poro < 200 A são mecanicamente muito estáveis.

Fases estacionárias com tamanho de partículas de 5 µm ou maiores podem ser usados na rotina com até 6.000 psi sem qualquer problema. Fases em HPLC Plus com tamanho de partículas de 3 µm podem ser usados com pressão de trabalho de até 8.700 psi. Colunas de UHPLC com tamanho de partículas de 2 µm aguentam uma rotina de até 14.500 psi de pressão de trabalho. É sempre recomendável que se trabalhe abaixo da pressão máxima de trabalho permitido para garantir uma maior vida útil da coluna.

Choques de pressão devem ser evitados. Diferenças bruscas de pressão de trabalho podem levar a formação de canais no empacotamento da coluna, o que pode resultar na quebra de picos no cromatograma correspondente. Para fases estacionárias com tamanho de poro > 200 A, a pressão máxima de trabalho pode ser menor. Entre em contato com o fabricante para ter certeza.

Fases móvel (eluentes)

Fases estacionárias com base de sílica são compatíveis com todos os solventes orgânicos na faixa de pH mencionada.

Para melhores resultados, os solventes disponíveis de melhor qualidade, de grau HPLC, devem ser usados. Todas as soluções tampão devem ser filtradas por um filtro de 0,45 µm antes de usá-las no seu cromatógrafo líquido. Mantenha sempre em mente que sua coluna vai reter qualquer material particulado que entre no fluxo do sistema. O uso de solventes impuros no HPLC provoca adsorção irreversível de impurezas na cabeça da coluna. Estas impurezas bloqueiam sítios de adsorção, mudam a seletividade da coluna e eventualmente levam a quebra dos picos no cromatograma. Na eluição com gradiente, estas impurezas geram os picos fantasmas. Picos fantasmas são picos que sempre aparecem na mesma posição no cromatograma. Sua origem não é a amostra, mas as impurezas de solventes ou outros aditivos encontrados nos solventes. Dessa forma, é altamente recomendável correr o gradiente sem injetar a amostra no início de cada método para determinar se picos fantasmas aparecem.

Para evitar adsorção irreversível na cabeça da coluna, você deve sempre usar uma pré-coluna. O uso da pré-coluna aumenta o tempo de vida da coluna de forma dramática. Além disso, a pré-coluna irá filtrar o material particulado vindo dos selos da bomba ou rotores de injeção. Uma alternativa à pré-coluna é um filtro de linha. Estes filtros são colocados entre a coluna e o injetor e novas versões podem ser montadas diretamente na coluna. Estes filtros são ótimos para remoção de material particulado do eluente, mas não conseguem substituir as pré-colunas removendo impurezas orgânicas que podem adsorver irreversivelmente à coluna.

Armazenamento apropriado de colunas cromatográficas à base de sílica

Colunas à base de sílica devem ser armazenadas com um solvente sem prótons. O melhor solvente para enchimentos de fase reversa (C18, C8, C4, C1, C30, CN e fenil) é acetonitrila/ água (50:50 v/v). O conteúdo de água não deve ultrapassar 50%. O melhor solvente de estocagem para enchimentos de fase normal (sílica, diol, nitro, ciano e amino) é hexano/ isopropanol 90:10 v/v. O melhor solvente de estocagem de colunas HILIC (HILIC, amino e sílica) é acetonitrila/ água (90:10 v/v) ou acetonitrila/ 5mM acetato de amônia, pH 5,3 (90:10 v/v). O conteúdo de acetonitrila deve ser sempre superior a 90%.

CUIDADO!

Soluções tampão de sal podem entupir as colunas e os capilares do cromatógrafo líquido. Elas não são solúveis em acetonitrila. Até para uma armazenagem rápida, lave toda a solução tampão da coluna para prevenir crescimento de algas. Certifique-se que todas as soluções tampão foram lavadas da coluna antes de trocar fases móvel aquosas por solventes orgânicos.

Tempo de equilíbrio

O tempo de equilíbrio da coluna depende das dimensões da coluna. Em geral, a coluna é equilibrada depois que 20 volumes da coluna foram passados por ela.

Os tempos de equilíbrio das dimensões mais comuns de coluna estão resumidos na tabela a seguir. Você pode reduzir o tempo de equilíbrio simplesmente aumentando a vazão. Entretanto, certifique-se de lavar a coluna com pelo menos 10 a 20 volumes para garantir que a coluna foi equilibrada.

Regeneração de uma coluna

Recomendamos a regeneração de uma coluna se for observada a alteração no formato do pico, resolução ou aumento na pressão de trabalho. Se a pressão do sistema começar a subir, remova a coluna e verifique o sistema para determinar se o aumento de pressão se deu por causa do sistema ou da coluna.

Aumento de pressão causado pelo sistema: lave o sistema, troque os filtros dos eluentes, filtros de linha e/ou capilares.

Aumento de pressão causado pela coluna: inverta a coluna e lave-a com cuidado para remover formação de partículas no filtro de entrada (conecte a saída da coluna à bomba/ injetor e lave). Não conecte a coluna ao detector.

Imagem - fonte: http://analyteguru.com/hplc-column-for-glycan-separation-by-size-polarity-and-charge/

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