A cromatografia por exclusão de tamanho separa as moléculas de acordo com a sua diferença de tamanho. Essa técnica de biocromatografia é usada para fracionar proteínas e para o processo de retirada de sal da proteína.
Vantagens da cromatografia de exclusão de tamanho
- Boa separação de moléculas grandes de moléculas pequenas, com um mínimo de volume de eluente;
- Alta resolução;
- Preserva a atividade biológica das partículas;
- Sem perda de amostra porque o soluto não interage com a fase estacionária;
- Várias soluções podem ser aplicadas sem interferir com o processo de filtração.
A dinâmica dessa técnica cromatográfica é a seguinte:
- As moléculas menores conseguem entrar nos poros mais facilmente e, portanto, passam mais tempo nesses poros. Dessa forma, elas eluem por último.
- As maiores moléculas gastam pouco ou nenhum tempo nos poros da resina, e, dessa forma, são eluídas rapidamente.
- É preciso conhecer os tamanhos moleculares das moléculas a serem separadas para uma boa escolha da coluna a ser usada. Todas as colunas vêm com a informação da faixa de pesos moleculares que podem ser separados.
As aplicações mais comuns da cromatografia de exclusão de tamanho, técnica de biocromatografia muito usada na etapa de polimento na purificação de proteínas, estão representadas abaixo pelos seus cromatogramas.
No cromatograma podemos observar claramente a separação das moléculas grandes (eluem primeiro da coluna) das moléculas menores (eluem por último). No caso da dessalinização abaixo, o sérum de albumina bovino (BSA) é o primeiro a eluir e fica completamente separado das moléculas de sal, pequenas, que ficam retidas na coluna. Dessa forma, consegue-se nessa técnica obter a proteína de interesse em uma solução de pH neutro, pronta para armazenagem e uso. Essa proteína pode ter passado por processos anteriores de purificação (como cromatografia por afinidade, por exemplo), e precisa agora ser desalinizada.
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A cromatografia de exclusão de tamanho é extremamente útil na fase de polimento, conforme mencionado anteriormente. Entretanto, a técnica possui suas limitações. Veja abaixo suas principais características:
- Isocrático;
- Baixa vazão;
- Colunas longas;
- Pequeno volume de amostra;
- Pequenas frações;
- Simples;
- Consome muito tempo.
Economizando tempo: Injeção parcelada
Após a seleção do meio para a cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), o volume da amostra e as dimensões da coluna são os dois parâmetros mais críticos que afetarão a resolução da separação.
Para a maioria dos métodos que utilizam a técnica SEC, o volume da amostra não deve exceder 2% do volume total da coluna, para que a resolução máxima possa ser alcançada. Para volumes de amostra maiores, a amostra deve, portanto, ser dividida em diferentes execuções. No entanto, isso leva muito tempo e não é muito eficiente.
O software PurityChrom disponibiliza a programação de injeção parcelada (chamada de “stacked injection”). Com a injeção parcelada, é possível executar diferentes injeções, automaticamente, uma após a outra. A injeção da próxima corrida ocorre durante a corrida atual, de modo que o tempo até a eluição do primeiro pico possa ser totalmente explorado. Isso aumenta a eficiência e economiza tempo nessa técnica que possui o tempo e volume de amostra como limitação.
Vantagens
- Aplicável em métodos isocráticos, como SEC (apenas 2% do volume da coluna)
- Executa diferentes corridas, automaticamente, uma após a outra
- Economia de Tempo
- Aumenta a eficiência
Cromatograma típico de exclusão por tamanho, mostrando o tempo de eluição que pode ser aproveitado
Cromatograma de exclusão de tamanho utilizando a função de Stacked injection.
AZURA BIO SEC – A solução para suas corridas de cromatografia por exclusão de tamanho
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Especificações
- Bomba isocrática até 10 ml/min
- Válvula de injeção para injeção de amostra no loop de amostras
- Detector UV / Vis com comprimento de onda único mas variável
- Coletor de frações para fracionamento
- Compatível com todas as colunas do mercado
- Software PurityChrom® com métodos pré-cadastrados
- Pressão máxima: 200 bar
