Estratégia para purificação de macromoléculas biológicas
A cromatografia de afinidade é uma das estratégias utilizadas para purificação de macromoléculas. As misturas bioquímicas tem naturalmente diferenças estruturais que favorecem uma interação altamente específica entre antígeno e anticorpo, enzima e substrato, ou receptor e ligante. Macromoléculas biológicas, como enzimas e outras proteínas, interagem com outras moléculas com alta especificidade através de vários tipos diferentes de ligações e interações.
A elevada seletividade da cromatografia de afinidade é conseguida ao se permitir que a molécula desejada interaja com a fase estacionária e sofra uma ligação reversível dentro da coluna a fim de ser separada do material indesejado. A seletividade sempre ocorre quando o material indesejado não interage com a coluna e elui, portanto, primeiro.
Macromoléculas biológicas interagem com outras moléculas de forma muito específica por vários tipos diferentes de ligações e interações, como por exemplo, ponte de hidrogênio, interação iônica, pontes dissulfeto e interação hidrofóbica.
Captura da proteína de interesse
A cromatografia por afinidade, dentro da biocromatografia, é muito utilizada como primeira estratégia de limpeza da cultura de células para se reter a proteína de interesse. Dessa forma, é utilizada na primeira fase de purificação, a chamada fase de captura. Grandes volumes de amostra podem ser utilizados, e a alimentação de amostra nesse sistema geralmente é feita através de bomba de amostragem. Ao passar pela coluna, a proteína de interesse se liga temporariamente à coluna de forma específica, e todo o material restante é descartado do sistema. Em seguida, é realizada a lavagem da coluna com uma solução tampão, em geral, de pH mais baixo, competindo pelas ligações da coluna e eluindo a proteína de interesse, que é então coletada em um coletor de frações ou através de uma válvula de fracionamento.
A dinâmica da interação por afinidade da biomolécula está representada na animação a seguir:
Cromatograma típico
Em um cromatograma típico de uma análise cromatográfica por afinidade, conforme indicado abaixo, encontramos as seguintes áreas:
- Após o equilíbrio do sistema com a solução tampão de pH neutro, a amostra é injetada e a proteína de interesse é retida na coluna por afinidade. A solução tampão então arrasta todos os outros materiais indesejados para fora da coluna e do sistema, direcionando-os para o descarte. Esse material indesejado é detectado no grande pico em azul na área 1.
- Após a coleta do descarte, a solução tampão de pH mais baixo é injetada no sistema, que gradualmente vai aumentando sua condutividade, que pode ser medida por um condutivímetro acoplado no sistema. Nessa área a proteína de interesse ainda está retida na coluna, como indica a segunda parte do cromatograma.
- Quando a concentração salina na coluna atinge o nível ideal para eluir a proteína de interesse, ela é arrastada da coluna e é detectada pelo detector nessa terceira área do cromatograma.
- Em seguida, a solução tampão de equilíbrio do sistema é reinjetada, de forma a lavar todo o sistema e a coluna, deixando os sítios ativos novamente disponíveis para uma nova injeção de amostra.
Características da biocromatografia por afinidade
Na cromatografia de afinidade, encontramos as seguintes características:
- Altas vazões
- Colunas pequenas
- Volume grande de amostra
- Isocrático
- Grandes frações
- Método simples
Aplicações da cromatografia por afinidade
- Anticorpos – Proteína G e proteína A com afinidade pelas regiões Fc dos anticorpos
- Proteínas com tags – Cromatografia de afinidade por metal imobilizado – IMAC (His-Tag), Glutationa (GST)
- Glicoproteínas, polissacarídeos– lectinas imobilizadas
- Substratos análogos, inibidores, cofatores – Meios com enzimas acopladas
FPLC compacto para cromatografia de afinidade
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