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Seleção de Resina na Cromatografia de Troca Iônica

As resinas da cromatografia de troca iônica são compostas de grupos funcionais positiva e negativamente carregados, ligados covalentemente a uma matriz sólida. Matrizes comuns são celulose, agarose, polimetacrilato, poliestireno e poliacrilamida. As últimas três matrizes são as que permitem as vazões mais altas.

Muitos fatores devem ser levados em consideração para a escolha da resina:

• Trocador aniônico x trocador catiônico
• Trocador de íons forte x fraco
• Forma iônica da resina
• Tamanho de partícula da resina
• Vazão máxima permitida
• Capacidade de ligação dinâmica

Decidindo entre fazer a troca iônica com um trocador catiônico ou aniônico

Para muitos fluxos de trabalho de purificação de proteínas, a dobra da proteína e sua estabilidade são preocupações comuns. Nesses cenários, a seleção de um trocador aniônico ou catiônico depende da estabilidade da proteína de interesse.

Algumas proteínas são estáveis tanto acima quanto abaixo do seu pl. Estas proteínas podem ser purificadas tanto com um trocador aniônico como catiônico. Outras proteínas são estáveis somente acima ou abaixo do seu pl. Para estas proteínas, a estabilidade dita a escolha da resina. Se por exemplo, a proteína é estável apenas imediatamente acima do seu pl, uma resina de troca aniônica deve ser escolhida. Quando a estabilidade da proteína não for uma preocupação, tanto um trocador aniônico quanto um catiônico podem ser utilizados.

Trocadores iônicos fortes x fracos

Resinas de troca iônica vem de duas formas: forte e fraca.

O número de cargas em um trocador iônico forte permanece constante independentemente do pH do tampão. Estes tipos de resinas mantêm sua seletividade e capacidade ao longo de um grande intervalo de pH. Exemplos de trocadores iônicos fortes são resinas de amônio quarternário (Q), sulfonate (S) e sulfopropil (SP).

Trocadores iônicos fracos, por outro lado, demonstram-se bastante dependentes do pH e só conseguem trabalhar de forma ótima em um pequeno intervalo de pH. Quando o pH do tampão não corresponder mais à constant de dissociação ácida (pKa) do grupo functional da resina, estas resinas sofrem perda significativa de capacidade.  Trocadores aniônicos fracos não funcionam muito bem no pH acima de 9 e trocadores catiônicos fracos começam a perder sua ionização abaixo do pH 6. Quando se trabalha com resinas de troca iônica fracas como resinas de dietilaminoetil (DEAE) or carboximetil (CM), é importante que se trabalhe também com o intervalo de pH conforme indicado pelo fabricante.

* Consulte as instruções do fabricante para o interval de pH para cada resina individual. Proteínas de interesse podem não ser estáveis através do interval inteiro do pH.

Trocadores iônicos fortes são normalmente as resinas preferidas para muitas aplicações porque sua performance não é afetada pelo pH. Entretanto, trocadores iônicos fracos podem ser ferramentas de separação ponderosas em casos onde os trocadores iônicos fortes falharam devido à seletividade diferenciada entre trocadores iônicos fortes e fracos.

Forma iônica de Resinas para IEX

A forma iônica de um suporte se refere ao contra-íon que é adsorvido pelos grupos funcionais da resina. Este íon pode ser alterado através da troca do tampão de equilíbrio da coluna. Contra-íons comuns para trocadores aniônicos e catiônicos são Na+ e Cl-, respectivamente.

A força da Interação com uma dada resina varia para diferentes contra-íons. Quanto mais baixa a seletividade de cada contra-íon para cada suporte, mais facilmente ele pode ser trocado por outro íon de carga parecida (por exemplo, a proteína de interesse). Da mesma forma, um tampão de eluição contendo um contra-íon com seletividade relativamente baixa para o suporte irá retirar as proteínas da resina da coluna menos facilmente durante a eluição. Em alguns casos, essa diferença pode ser explorada, e contra-íons como Li⁺, Br^–, e SO₄^2- são usados frequentemente para melhorar a seletividade da resina.

Tamanho de Partícula da Resina

O tamanho de partícula da resina se refere ao tamanho do suporte sólido da resina. O tamanho da partícula não afeta a seletividade da resina, mas impacta na resolução.

Fig. 6. Relação entre o tamanho de partícula da resina, pressão e resolução

Partículas menores promovem maior resolução, mas tipicamente requerem vazões de trabalho mais baixas. Meios de alta resolução são usados comumente para escala de trabalho analítica ou produção de pequena escala, assim como nas etapas finais de polimento da cromatografia preparativa. Amostras muito viscosas como amostras limpas de lisatos de E.coli ou amostras contendo glycerol muito frequentemente não conseguem ser separadas usando-se resinas de troca iônica de pequenas partículas. Isso se deve porque é observado um aumento na pressão de trabalho quando se utiliza resina de partículas pequenas, que podem ultrapassar o limite máximo da coluna.

Partículas grandes permitem que se trabalhe com uma vazão alta, mas atingem resoluções mais baixas. Um método que gera picos estreitos e finos usando-se uma resina de partículas pequenas irá resultar em picos mais largos e menos definidos quando se utilizar uma resina de partículas maiores. Resinas de partículas grandes são uma excelente escolha quando se tem uma grande escala de trabalho ou escala preparativa. Tamanhos de partículas grandes também são a melhor opção quando as amostras são viscosas, como quando IEX é utilizado como primeiro passo no fluxo de purificação de proteínas.

Vazão de trabalho

A vazão de trabalho se refere a quão rápido o tampão irá passar sobre a resina. O fluxo de trabalho determina, portanto, a quantidade de tempo no qual as proteínas podem interagir com a resina da coluna, que é chamado de tempo de residência de uma coluna particular a uma determinada vazão de trabalho. Diferente do tamanho de partícula, a vazão afeta tanto a resolução quanto a capacidade: tempos de residência mais longos aumentam tanto a capacidade quanto a resolução de uma resina.

Fig. 7. Efeito da vazão de trabalho sobre a resolução na IEX. Separação de uma amostra de 5mL de mioglobina (pico 1), ribonuclease (pico 2) e citocromo (pico 3) em uma coluna de troca catiônica 1 x 13 cm (8.7 ml) Macro-Prep^® High Q.

Vazões de trabalho não são somente limitadas pela perda de resolução,e capacidade quando a vazão é aumentada, mas também pela própria resina. À medida em que a vazão cresce, a pressão na resina aumenta. Se a pressão de trabalho fica muito alta, ela pode esmagar a resina da coluna. Dessa forma, os fabricantes informam o limite de pressão pra todas as suas resinas.

Geralmente é escolhida a maior vazão sob a qual ainda se consegue manter a capacidade e resolução desejadas. Apesar de menores vazões apresentarem ainda melhor capacidade e resolução, isso ocorre geralmente ao custo da atividade da proteína, já que muitas proteínas perdem sua atividade com o tempo sob as condições a que são submetidas no sistema cromatográfico.

Capacidade de ligação dinâmica da resina

A capacidade de ligação dinâmica da resina se refere à quantidade de proteína que a resina consegue se ligar a uma determinada vazão. É geralmente expressa em mg/ml de proteína ligada a uma determinada vazão.Este valor varia de resina pra resina e pode ser importante quando vazões mais altas são necessárias para manter a atividade da proteína.

Fonte: http://www.bio-rad.com/en-us/applications-technologies/liquid-chromatography-principles/ion-exchange-chromatography

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